장인은 도구를 가린다! 현미경도 가릴까? (1)

ps.  그냥 공부하려고 끄적이는 글임을 알립니다. 먼저 틀린 부분이 있을 수도 있으니 어떤 분이라도 보신다면 과감한 소신발언.. 달게 듣겠습니다..

현미경 종류를 알아보자! 

대물렌즈 돌릴 때마다 기분 좋아졌던 1ㅅ

 

현미경 종류는 왜 이렇게 많을까? 이 작은 것 하나 관찰하겠다고 몇 종류를 만든 거야..

생각해 보니 한 길 빨리 달리겠다고 차도 여러 종류로 만들었구나..ㅎㅎ

 

미생물을 미생물을 관찰하는 데 가장 기본적인 도구 중 하나인 현미경

미생물을 관찰하기 위해 광학현미경(light microscopy)이나 전자현미경(electron microscopy)과 같은 현미경이 필요하다. 또 모든 현미경은 대상을 확대하여 관찰하는 데 렌즈를 이용한다.

 

배율(magnification)과  해상력(resolution)?

 

복합 광학현미경의 경우 현미경 배율은 접안렌즈, 대물렌즈 배율의 곱이다. 접안렌즈가 10X, 대물렌즈가 100X이면 눈에 맺히는 상의배율은 1,000X이다. 해상력(또는 해상도;resolution)은 배율과 다른 개념으로 떨어져있는 두 점을 구분하는 것이다. 구분 가능한 두 점 간의 거리가 짧을수록 해상력 짱인 현미경이다. 

 

광학은 저배율로 세포를 관찰하는 데 사용하고 전자는 고배율로 세포 내부 구조를 관찰하는데 이용하지만 이 배율(magnification)이 작은 물체를 보는데 어려움을 주는 제한적 요소는 아니다. 작은 물체를 볼 때, 두 개의 인접한 물체를 분명하게 구별할 수 있는 능력인 해상력(resolution)이 관찰 능력을 좌우하는 것이다.

배율은 제한 없이 증가시키고 싶은 만큼 증가시킬 수 있지만 해상력은 빛의 물리적인 특성에 의해 결정되기 때문에 한계가 있다.

 

* 해상력 수식적 의미

   d = 0.5 λNA

   [d = 해상력으로 구분되는 두 점 간 거리

   λ = 빛의 파장

   NA = 개구수치(numerical aperture)

> 해상력이 좋으려면 d 값이 작거나 NA 값(;각 대물렌즈에 표시되어 있음)이 커야한다. 

 

광학현미경의 최대 배율은 약 2,000배이고 이 이상의 배율에서는 해상력을 향상시킬 수 없다. 해상력은 사용하는 빛의 파장, 대물렌즈의 고유 성질인 개구수(numerical aperture; 빛을 집광하는 능력)에 의해 좌우된다. 이는 렌즈로 들어오는 빛의 각도와 렌즈 및 시료 사이의 매질(대부분 공기)에 의해 결정된다. 배율과 개구수 사이에는 상관관계가 존재하는데, 렌즈 배율이 높을수록 보통 개구수도 높다. 최고 해상력이 0.2μm라면 두 물체가 0.2μm보다 가까운 거리에 있을 시 명확하게 구분할 수 없다는 것을 의미한다. 개구수가 높은 일부 대물렌즈를 이용할 경우, 표본과 대물렌즈 사이에 오일을 사용(NA 값이 커짐)하기도 한다. 오일이 사용되는 렌즈를 유침(oil-immersion) 렌즈라고 한다. 이때 오일은 렌즈의 집광 능력을 향상시키는 역할(반사각 조절)을 맡는다.

 

 

* 렌즈의 해상이 가능한 최소 물체의 지름을 구하는 수식 : 0.5 λ/개구수 (λ : 사용되는 빛 파장)

> 최고의 해상력은 파장이 짧은 청색광과 높은 개구수를 가지는 대물렌즈 조합

   긴 파장의 빛을 제거하면 해상력 증가 (achromat, apochromat 렌즈가 이러한 종류)

 

 

현미경의 종류를 진짜로 알아보자!

1. 광학 현미경

Figure 1. The compound light microscope

 

광학현미경(light microscopy)에도 명시야(bright-field), 암시야(dark-field), 차등 간섭 대비(differential interference contrast), 위상차(phase-contrast), 형광(fluorescent) 등과 같이 다양한 종류가 존재한다.

 

명시야 현미경 (bright-field microscope)

주위 환경과 표본 물체 사이에 존재하는 명암 대비차(contrast difference)로 표본이 형상화되는 원리(표본마다 빛을 흡수, 산란하는 정도가 다름!)이며, 두 종류의 렌즈인 대물렌즈(objective)와 대안렌즈(ocular)로 상을 구현한다. (Figure 2. 좌) 세균 세포 같은 경우, 주변 환경과의 대비차가 부족해 위상차와 같은 현미경을 이용하기도 하며 명암 대비를 확실하게 하기 위해 염색법을 쓰기도 한다. 염색법 관련은 따로 다루겠다! 나는 절대 안졸리다 나는 절대 안졸리다 나느 절대 안졸라다

 

위상차 현미경 (phase-contrast microscope)

염색법을 사용하지 않고 살아 있는 세포를 관찰할 수 있는 현미경 중 하나이다. (염색하지 않은 상태에서 cell과 주위의 음영대비를 높여주는 것) 이 현미경은 cell의 주변 환경을 비교하여 세포의 굴절지수(refractive index; 물질을 통과함에 따라 빛의 속도가 줄어드는 지수)가 다르다는 점에 초점을 두고 있다. 세포를 통과한 빛은 주변을 통과한 빛과 위상이 달라지게 되고 이 달라진 phase 차이를 위상차 현미경의 objective 내에 장착되어 있는 phase ring으로 증폭시켜 밝은 배경에 어두운 이미지를 형성하는 것이다. (phase ring으로 파동이 빨라지거나 늦어지게 만든다)

 

위상차 현미경은 광물리를 이용한 것이므로 광물리학을 이해해 볼 필요가 있다.

빛은 amplitute와 wave length를 가진 파동이고, 대부분의 물질에 빛이 통과하면 빛의 amplitute가 줄어들고, 그 결과 현미경에서는 어둡게 나타난다. 반면에 amplitute에 영향을 받지 않고 투과된 빛은 밝게 나타난다.

또 cell과같이 투명한 물질에 빛이 통과하면 amplitute는 변하지 않고 파동이 1/4 늦어진다. 이런 현상은 phase shift라고 한다. 이것으로는 명암이 크게 달라지지 않는다. 위상차는 파동이 늦어지는 것을 이용하여 밝게 또는 어둡게 관찰 가능하지만, 광학은  phase shift가 일어나지만 세포기관과 매질의 밝기 때문에 세포기관을 구분하기가 쉽지 않다. 때문에 광학에서는 염색을 해야 관찰이 가능하다.

 

빛은 투명한 물질을 만나면 아무런 영향을 받지 않은 직사광(direct)과 파동이 지연된 회절광(diffracted)의 상태로 나온다. 직사광은 medium으로부터 진폭 및 파장에 아무런 영향을 받지 않은 상태지만 회절광은 매질의 밀도 차이 때문에 파동이 1/4 느려진 상태로 바뀐다. 이 두 종류의 광이 만나면 파동이 중첩되며 진폭이 달라지는데, 만약 같은 phase의 빛이 만나면 보강간섭(진폭 2배)으로 밝은 영상이 생기고 phase가 정반대인 빛이 만나면 상쇄로 빛이 소면되어 어둡게 된다. 이를 간섭(interference)이라고 한다.

 

암시야 현미경 (dark-field microscope)

암시야 현미경도 위와 같이 염색법 없이 살아 있는 세포를 관찰할 수 있는 현미경이다.  생물시료(특히 cell)는 광투과성이 좋아 일반적인 광학으로는 잘 관찰하기 어렵다. 이 경우 배경 빛을 없애고 시료가 반사하는 빛만 보면 관찰이 용이하다. 검은 옷에 묻은 먼지가 유독 잘 보이는 것과 같은.. 이 현미경은 빛이 측면에서만 sample에 도달한다. 렌즈에 도달하는 유일한 빛은 sample에 의해 산란되는 빛들로, 상은 어두운 배경에서 밝게 나타난다.

* 광원에서 나온 빛이 콘덴서를 거쳐 대물렌즈로 들어가지 않음 > 어두운 배경

암시야의 경우 광학현미경에 비교하여 높은 해상력을 가지고 있으며 위상차, 명시야로는 해상 될 수 없는 표본이 암시야로 가능한 경우도 있다. 

 

ex. 미생물의 이동성 관찰(뭉쳐있는 flagella; 유영 이동 관여 구조) 등.

 

시료를 올리는 슬라이드 글라스 자체도 빛을 굴절시키기 때문에 암시야에서 사용하는 슬라이드는 규격이 맞는 깨끗한 것만 커버 글라스와 함께 사용해야한다.

 

형광 현미경 (fluorescent microscope)

다른 색의 빛을 흡수한 후, 단일 색의 빛을 방출함으로 형광을 띄게 하여 표본을 형상화한다. (Figure 2. 중)

cell은  엽록체나 autofluorescence와 같은 천연 형광물질을 함유하거나 형광 염료로 염색된 경우에 형광을 나타내며 대조염색을 통한 세포의 대략적 위치 및 조직을 파악할 수도 있다.

가장 많이 사용되는 형광 염료는 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이다. DAPI는 cell 내의 DNA와 결합(A-T의 영역에 강하게 결합)하고 시료 관찰 시 밝은 청색이 방출되는 것을 확인할 수 있다. (Figure 2. 우) 또한 살아있지 않은 cell에서는 막을 효율적으로 통과하는 경향이 있다. DAPI 관련 내용은 따로 다루겠다. 왜 A-T 영역에 강하게 결합하는 거였지?..ㅎ ㅎ

 

파란색? why!

DNA binding 시, DAPI는 385nm의 파장에서 흡수를 가지고 최대 방출은 461nm(청색 계통)에서 나타난다. 이때 자외선으로 여기 되고 푸른/청록색 필터를 통해 감지되며 파란빛 형광을 볼 수 있게 된다. 

  

 

차등 간섭 대비 현미경(differential interference contrast microscope, DIC)

일반적으로 염색시키지 않은 cell 관찰에 사용되며 집광기 내의 polarizer를 이용해 편광을 방생시키는 원리를 이용한 현미경. (Figure 3) 편광이 프리즘을 통과한 후, 이들 상이한 광선은 표본을 통과하고 대물렌즈에 진입하게 되며 한 개의 광선으로 결합된다. 표본을 통과한 광선은 굴절지수에 차이가 있어 완전 동일한 위상에 있지 못하고 서로 간섭효과를 내게 된다. 이는 구조의 작은 차이를 확대하는 효과를 내기 때문에 endospore와 같은 구조가 좀 더 3차원적 형태로 보이게 한다. 

 

공초점 주사 레이저 현미경 (confocal scanning laser microscope, CSLM)

레이저와 형광 현미경의 콜라보로 컴퓨터로 조절되는 현미경이다. (Figure 4) 참 신기한 것도 많다. 레이저가 밝은 3차원 형상을 생성하고 표본의 다양한 위상에 따라 초점을 맞출 수 있게 한다. 레이저 광선을 표본의 한 위상의 수평면만을 정확하게 조절하여 한 위상 수평면만 발광하게 한다. 이때 CSLM은 초점이 다른 위상 수평면에서 방출되는 다른 빛들을 제거한다. 레이저 광선의 위상 수평면 초점은 조절할 수 있으며 두께가 있는 표본의 경우 다양한 위상에 있는 것들도 함께 관찰이 가능하다.

CSLM에 이용할 샘플은 형광 염료로 염색이 가능하다. 또 디지털 영상을 만들 수 있는 컴퓨터가 포함되어 있어 형광 염색한 시료와 염색하지 않은 시료가 섞여도  전체 시료의 3차원적 구조를 알 수 있게 디지털 방식으로 구성할 수 있다.

결국 한 관찰 이미지를 생성할 때, 레이저로 한 위상의 수평면만 조절하여 clear 하게 이미지를 뽑아낼 수 있고 이러한 다양한 위상에서 얻어진 자료들이 종합되어 컴퓨터에서 3차원적 구조로 생성된다는 건가?

 

Figure 2. 좌:cyanobacteria의 명시야 현미경 관찰, 중: cyanobacteria의 형광현미경 관찰, 우:E.coli의 DAPI 염색 관찰

 

Figure 3. 차등 간섭 대비 현미경 관찰; Saccharomyces cerevisiae

 

Figure 4. 공초점 주사 레이저 현미경; 필라멘트형  cyanobacteria

 

 

광학 현미경 이외에 전자 현미경도 존재한다. 전자 현미경은 관찰을 위해 가시광선(광자) 대신 전자를 사용한다. 전자 현미경은 다음 이 시간에..

 

 

<여담>

무려 진공에서 작동하는 현미경.. 한 번도 써본 적이 없어서 궁금하다.. 좋은 기회가 왔으면!

안 끊고 한 번에 쓰려고 했지만.. 왜 항상 하고 싶은 건 잠들기 직전에 생각이 나는 걸까요?

야식도 너무 먹고 싶고.. 컵라면.. 컵라면이 먹고 싶다!